上篇
杜氏肌营养不良
从病因到治疗
-Duchenne muscular dystrophy，DMD-
杜氏肌营养不良（下文简称DMD）是一种严重的X染色体隐性单基因遗传病，表现为近端肢体肌无力，病因是肌肉细胞中dystrophin蛋白的缺失。DMD主要发病于男性儿童，患者一般在3-5岁首次出现症状，包括肌肉炎症、纤维化、运动能力下降等，如不进行治疗多数患者在20岁之前将失去独立行走能力，30岁之前死亡。死因多为心肌和膈肌（呼吸肌）的衰竭。
DMD唯一致病基因是X染色体上的DMD基因（是的，致病基因和疾病的缩写一样，对于写文非常的不方便！下文疾病简称“DMD”，基因简称“DMD基因”）。
一、DMD基因简介
DMD基因是人体内最大的基因，全长220万个碱基，有79个外显子。因为序列过长，DMD基因在细胞核内转录为pre-mRNA需要超过16小时，并且在转录同时即开始剪切拼接为mRNA。
DMD的mRNA在细胞质中翻译为蛋白质dystrophin，dystrophin在肌肉细胞中和F-actin等蛋白结合形成蛋白复合体，在肌肉收缩和舒张中起到稳定细胞骨架，稳定肌膜，防止肌肉损伤的作用，dystrophin在神经系统中也可起到稳定神经肌肉连接的作用。
图 1 DMD基因的外显子，功能和不同组织中的剪切方式（10.1038/s41572-021-00248-3）
Dystrophin的canonical形式为427kD的Dp427m，主要分布在肌肉中。同样427kD的形式也分布于类淋巴母细胞，脑，浦肯野细胞中。通过可变剪切，使用不同的promoter或不同的polyA尾巴，dystrophin还有多种不同长度的同源异构体1，包括在视网膜中表达的Dp260，在中枢神经系统和肾脏中表达的Dp140，以及在Schwann cells中表达的Dp116等。
表 1 Dystrophin的 427kD 同源异构体
二、DMD的病因和分型
DMD基因的失活突变直接导致dystrophin蛋白的缺失，失活突变主要由大片段突变（缺失，重复）和小片段突变（缺失，插入，剪切位点，点突变等）组成。其中大片段缺失占60%以上，尤以3-22号外显子和45-54号外显子区域的缺失为突变热点。2015年，中南大学湘雅医院邬玲仟教授团队收集了国内613例DMD病例的遗传学信息，结果显示国内患者DMD基因突变的类型和比例和全球没有显著差异。
图 2 已知DMD基因的突变类型
并不是所有DMD基因的突变都会导致严重的肌肉萎缩，疾病严重程度和DMD基因突变后dystrophin的水平负相关。一般而言，大片段的缺失，阅读框的改变（out-of-frame），或者无义突变（non-sense）往往导致dystrophin大幅下降，若低于健康组织的5%，往往引发DMD的症状；而promoter区域的突变，内含子区域的突变，阅读框不变（in-frame）的突变往往导致dystrophin适量下降，导致相对温和的Becker muscular dystrophy (BMD)症状2。
临床表现上，BMD的患者发病较晚，多数直到成年依然保持了行走能力，血浆肌酐激酶往往只有DMD患者的1/5，并且多数人的寿命在30岁以上。部分BMD患者的基因型表现为in-frame mutation或者in-frame外显子缺失，为后续外显子跳跃疗法的开发提供了可行性和安全底线。
图 3 OMIM数据库中的DMD突变类型（截取前20）
OMIM数据库总结了文献报道的DMD和BMD突变类型，但受限于文献的覆盖面，这些数据维护较慢且和临床的真实情况可能存在偏差。在TREAT-NMD project资助下，法国马赛大学和INSERM的团队以法国比利时的患者的信息为基础，建立了UMD患者数据库3，对于超过2000名已知DMD基因突变的病例的频率进行了归纳总结，对于了解流行病学，基因分型和选择合适的外显子跳跃策略有一定的帮助。
图 4 UMD数据库中的部分DMD突变情况，按频率排序，其中虚线为out-of-frame突变，可见45-54是突变热点
三、DMD的诊断和流行病学
除了年龄，家族病史等因素，DMD患者的临床表现还包括肌酐激酶升高，转氨酶升高，肌电图异常等。肌肉组织活检和基因检测是DMD确诊的金标准4。
图 5 DMD的诊断流程
在已知的文献范围内，笔者没有找到覆盖面足够大的中国大陆的DMD流行病学的报告，基于临近的日本和香港特别行政区的报告，推测中国DMD的流行率为每10万男性8.5人（累计患者约6万人），这一数字和全球每10万男性7.1人的数据接近；中国DMD的发病率为每10万男性新生儿20人，和全球19.8人的数据接近。另外，如上文提到，国内DMD患者基因突变的类型和比例和全球没有显著差异。
图 6 DMD的流行病学
四、DMD的药物研究
相比DM1（全部都是DMPK 3UTR区域的CTG重复导致）和FSHD（D4Z4重复的降低），DMD虽是单基因遗传病，但基因突变的类型和导致的结果十分复杂多样。在条件允许的前提下，在患者的肌肉中恢复全长或接近全长的dystrophin，应优先于其他疗法，这需要充分研究不同病人的病因，并针对致病突变选择合适的治疗方案。病因以外，也需要考虑患者的年龄，病程和评估指标，药物的潜在副作用，精准递送的可能性等。
目前全世界各地获批用于DMD的药物包括糖皮质激素，基于PMO的外显子跳跃疗法，RNA通读疗法，基于AAV的基因治疗等。开发中的新型疗法还包括基因编辑，小分子RNA结合剂等。
五、
FDA关于DMD药物开发的技术指导原则
FDA于2018年正式发布DMD药物开发的技术指导原则。这一指导原则最初稿是由PPMD（患者联盟）在2014年首先撰写的，这是行业内首个最初由患者联盟撰写的经FDA批准的指导原则。FDA在2015年发布征求意见稿时对PPMD表达了感谢。
图 7 FDA 2015发布征求意见稿时对PPMD的感谢
这一指导原则的正文可以清晰的看出患者联盟对于DMD药物审批的巨大影响。在首个章节A1即提到DMD的严重性促使监管机构认识到DMD患者对于治疗方案可能具备更高的风险耐受能力。“FDA recognizes that those affected by life-threatening and severely debilitating illnesses with unmet medical need are generally willing to accept greater risks and greater uncertainties about risks.”
对于行业有深远影响的，还包括FDA提出通过基于生物标志物加速DMD药物获批。章节B7提到“Deficiency of functional dystrophin appears to be the proximate cause of the symptomatic and functional consequences of dystrophinopathies, justifying particular interest in dystrophin as a biomarker and as a potential surrogate endpoint for accelerated approval. ”这一条款对后续PMO疗法的上市起到了非常大的推动作用。
六、DMD与神经系统
DMD的病生理和治疗更多的关注心肌，膈肌以及骨骼肌。在肌肉以外，DMD的患者也呈现神经系统的症状，包括认知和行为的障碍等，推测这一现象和DMD基因在神经系统中的表达和功能有一定的关联。FDA在DMD药物开发的技术指导原则中鼓励道 “FDA could approve a drug for dystrophinopathies if a specific beneficial effect on the nervous system were demonstrated”。
DMD基因在CNS中主要表达为Dp140 和Dp71两种形式，这两种蛋白的缺失被认为和DMD的神经表型相关，但具体生物学机制并不清楚。在澳大利亚针对62个DMD患者的智商测试中，仅缺少Dp427的患者约有15%表现为智力障碍,同时缺少 Dp427 和Dp140的患者这一数据为25%，同时缺少Dp427、Dp140和DP71这一数据超过50%。
图 8 DMD患者智商测试和isoform的关系
To Be Continue...
下篇我们将对杜氏肌营养不良（DMD）的治疗手段进行总结与具体分析
尾声
迦进生物主要从事核酸生物偶联药物的开发，围绕神经肌肉疾病开发了基于抗体和多肽的差异化的递送载体和专利的偶联技术平台。我们希望通过高亲和力、高组织特异性的抗体和多肽实现包括PMO，AAV以及小分子的组织递送问题。同时抗体较长的血浆半衰期也能够弥补小核酸血浆半衰期不足，需要重复给药的问题。
迦进生物的抗体偶联PMO分子已经在临床前的DMD动物模型上取得了积极结果，单次给药后，我们在mdx小鼠的腓肠肌中恢复了近80%的全长dystrophin，并且能够维持至少一个月的时间。我们期待和社会各界一起努力，积极参与国际竞争，为国内DMD的患者提供可及，可负担，临床医生认可的药物。
参考资料
1. www.dmd.nl/同源异构体.html
2. www.mda.org/disease/duchenne-muscular-dystrophy/diagnosis
3. http://www.umd.be/
4. 10.1016/S1474-4422(09)70271-6
5. https://europepmc.org/article/MED/20098710
6. 10.2217/cer-2019-0170
7. PMC9425287
8. https://www.physio-pedia.com/North_Star_Ambulatory_Assessment
9. https://www.fda.gov/advisory-committees/advisory-committee-calendar/cellular-tissue-and-gene-therapies-advisory-committee-may-12-2023-meeting-announcement-05122023
10. https://doi.org/10.1101/2023.05.16.23289881
THE END